La eliminación de los receptores de leptina endoteliales en ratones promueve la dieta

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8276 (2023) Citar este artículo

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La obesidad promueve la disfunción endotelial. Las células endoteliales no solo responden, sino que posiblemente promueven activamente el desarrollo de la obesidad y la disfunción metabólica. Nuestro objetivo fue caracterizar el papel de los receptores de leptina endoteliales (LepR) para el metabolismo endotelial y corporal y la obesidad inducida por la dieta. Ratones con eliminación de LepR mediada por Tie2.Cre-ERT2 inducible por tamoxifeno en células endoteliales (End.LepR knockout, KO) fueron alimentados con una dieta rica en grasas (HFD) durante 16 semanas. El aumento de peso corporal, los niveles de leptina sérica, la adiposidad visceral y la inflamación del tejido adiposo fueron más pronunciados en los ratones obesos End.LepR-KO, mientras que los niveles séricos de glucosa e insulina en ayunas o la extensión de la esteatosis hepática no difirieron. En los ratones End.LepR-KO se observó una reducción de la transcitosis endotelial cerebral de la leptina exógena, un aumento de la ingesta de alimentos y un balance energético total, acompañado de una acumulación de macrófagos perivasculares en el cerebro, mientras que la actividad física, el gasto de energía y las tasas de intercambio respiratorio no difirieron. El análisis del flujo metabólico no reveló cambios en el perfil bioenergético de las células endoteliales del cerebro o del tejido adiposo visceral, pero sí mayores tasas de glucólisis y respiración mitocondrial en aquellas aisladas de los pulmones. Nuestros hallazgos respaldan un papel para los LepR endoteliales en el transporte de leptina al cerebro y el control neuronal de la ingesta de alimentos, y también sugieren cambios específicos de órganos en las células endoteliales, pero no en el metabolismo de todo el cuerpo.

La obesidad es un factor de riesgo cardiovascular establecido y frecuentemente asociado con disfunción endotelial1, uno de los primeros signos de enfermedad vascular. Los efectos perjudiciales de la obesidad están mediados por una serie de factores, incluida la inflamación crónica y las alteraciones metabólicas asociadas con el aumento del peso corporal. Además de las citoquinas liberadas por las células inflamatorias, las citoquinas producidas por los adipocitos (las llamadas adipoquinas) se han implicado en el aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular asociada con la obesidad. Entre otros, la obesidad se asocia con niveles circulantes elevados de leptina2,3, un prototipo de adipoquina involucrada en la regulación del peso corporal y el gasto energético4. Los receptores de leptina (LepRs) expresados en las células neuronales son cruciales para la regulación de la ingesta de alimentos y el gasto energético4. Los LepR también están presentes en las células endoteliales vasculares que forman la barrera hematoencefálica5. Estudios previos en ratones que expresaban LepR truncados unidos a la membrana en células endoteliales mostraron una absorción alterada de leptina en el tejido cerebral y una resistencia parcial a la obesidad inducida por la dieta6,7,8.

La leptina tiene funciones más allá de sus actividades como factor de saciedad. En este sentido, las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos periféricos también expresan LepRs9. Estudios experimentales y clínicos han implicado a la leptina en la fisiopatología de la disfunción endotelial3 y otras patologías cardiovasculares10,11. Anteriormente informamos que los ratones que carecen de LepR en las células endoteliales exhiben un fenotipo vascular que imita al de los ratones obesos resistentes a la leptina12. En esos ratones, observamos una adiposidad visceral más pronunciada en respuesta a la alimentación con una dieta rica en grasas. Esta y otras pruebas experimentales recientes sugieren que las células endoteliales no solo responden a la obesidad, sino que también pueden desempeñar un papel activo en la homeostasis energética de todo el cuerpo y en el desarrollo de la obesidad13,14,15. Sin embargo, pocos estudios han examinado este concepto, y los mecanismos y mediadores apenas comienzan a emerger16. En este estudio, examinamos la hipótesis de que la eliminación genética de LepR en las células endoteliales altera el fenotipo metabólico de los ratones y contribuye activamente al desarrollo de la obesidad inducida por la dieta alta en grasas (HFD).

Los ratones con deleción inducible de LepR en células endoteliales (End.LepR knockout, KO) se generaron previamente y se examinaron con respecto a su respuesta vascular12 o cardíaca17 a la lesión. El análisis de PCR del ADN genómico demostró la eliminación inducible mediada por Tie2.ERT2-Cre del gen floxed LepR (visible como LepR delta o Δ) en órganos involucrados en el control del peso corporal, como el cerebro o visceral (VAT) y subcutáneo (SCAT). ) tejido adiposo, así como en otros órganos, como intestino delgado y pulmón (fig. 1A). El análisis de PCR cuantitativo en tiempo real confirmó niveles de transcripción de ARNm significativamente reducidos de las isoformas LepR largas (señalización) y cortas en células endoteliales primarias aisladas del cerebro (Fig. 1B, C), VAT (Fig. 1D, E) y pulmón (Fig. 1F, G) de ratones End.LepR-KO, y se confirmaron inmunoseñales LepR bajas en células endoteliales positivas para CD31 mediante microscopía de inmunofluorescencia (Fig. 1H).

Generación de ratones con deleción genética inducible de LepR en células endoteliales. (A) Escisión del gen mediada por la recombinasa Cre inducida por tamoxifeno de los receptores de leptina (∆LepR) en biopsias de cerebro, tejido adiposo visceral (VAT), tejido adiposo subcutáneo (SCAT), intestino delgado y tejido pulmonar. Las imágenes completas de los geles de los que se recortaron las áreas de interés que muestran bandas se muestran en el archivo de información complementaria. Análisis PCR cuantitativo en tiempo real de LepR, isoforma larga (B,D,F) y corta (C,E,G), niveles de ARNm en células endoteliales aisladas del cerebro (B,C; n = 5–7 ratones por grupo) , VAT (D,E; n = 6 ratones por grupo) o pulmón (F,G; n = 6–8 ratones por grupo) de ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO. Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student (C-G) o la prueba de Mann-Whitney (B), según la presencia de distribución normal. *p < 0,05, **p < 0,01 y ****p < 0,001. (H) Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de la expresión de LepR (magenta) en células endoteliales inmunopositivas para CD31 (verde) en cerebro, VAT y pulmones de ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO. Los núcleos celulares se visualizaron usando DAPI (azul). Las barras de tamaño representan 20 µm.

El flujo de trabajo experimental para examinar el papel de los receptores de leptina endoteliales para la obesidad inducida por la dieta en ratones machos y hembras End.LepR-WT y End.LepR-KO se muestra en la Fig. 2A. En ratones alimentados con SD, los pesos corporales medios no difirieron significativamente entre los ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO (machos: 28,4 ± 0,4 frente a 28,1 ± 0,3 g, P = 0,5623; hembras: 21,1 ± 0,3 frente a 21,6 ± 0,2 g, P = 0,1210). Aunque todos los ratones desarrollaron obesidad en respuesta a HFD, los cambios de peso corporal promedio y el porcentaje de aumento de peso durante 16 semanas fueron significativamente mayores en los ratones End.LepR-KO en comparación con los controles End.LepR-WT de la misma edad, tanto en machos (Fig. . 2B,D) y ratones hembra (Fig. 2C,E). Las diferencias observadas fueron moderadas; En la Fig. 2F se muestran imágenes representativas de ratones compañeros de camada End.LepR-WT y End.LepR-KO alimentados con SD o HFD durante 16 semanas.

Cambios en el peso corporal en respuesta a una dieta rica en grasas. (A) Flujo de trabajo experimental. Curvas de progresión del peso corporal de ratones macho (B) y hembra (C) End.LepR-WT y End.LepR-KO al inicio y después de la alimentación con dieta alta en grasas (HFD) durante 4, 8, 12 y 16 semanas. El número de ratones examinados por grupo se muestra en los gráficos. *p < 0,05 y **p < 0,01, según lo determinado mediante ANOVA bidireccional, la prueba de comparación múltiple de Sidak. Aumento de peso corporal después de 16 semanas de HFD, expresado como porcentaje del peso corporal inicial (establecido en 100 %), en ratones macho (D) y hembra (E) End.LepR-WT y End.LepR-KO. **p < 0,01, determinado mediante la prueba t de Student. (F) Fotografías representativas de ratones machos y hembras End.LepR-WT y End.LepR-KO alimentados con una dieta de laboratorio estándar o una dieta rica en grasas durante 16 semanas.

Después de ser alimentados con HFD durante 16 semanas, los ratones fueron sacrificados. En este momento, los pesos del tejido adiposo visceral (VAT) fueron significativamente diferentes solo en los ratones hembra End.LepR-KO, mientras que fueron más altos en los machos que en las hembras y no difirieron significativamente entre End.LepR-WT y End.LepR- Ratones KO (Fig. 3A). De acuerdo con estos hallazgos, los niveles circulantes totales de leptina, un indicador de la masa de tejido adiposo periférico18, aumentaron significativamente solo en los ratones hembra End.LepR-KO en comparación con los controles End.LepR-WT y no difirieron en los machos (Fig. 3B ). Los niveles plasmáticos del receptor de leptina soluble (sLepR), la principal proteína de unión e inhibidor de la leptina19,20, no difirieron entre los ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO machos y hembras (no se muestra). El análisis histológico de secciones transversales teñidas con H&E a través de VAT confirmó un área media aumentada de adipocitos individuales en ratones hembra End.LepR-KO y un área media de adipocitos más alta, pero similar, en machos (Fig. 3C, D). Se confirmó una hipertrofia de adipocitos más pronunciada en ausencia de LepR endotelial a nivel molecular: el análisis de QPCR de los homogeneizados de VAT totales de ratones hembra mostró que los niveles de ARNm de adipocitos de la proteína 4 de unión a ácidos grasos (Fabp4) (Fig. 3E), proliferador de peroxisomas El receptor gamma activado (Pparg) (Fig. 3F) y la catenina beta-1 (Ctnnb1) (Fig. 3G), implicados en el transporte de lípidos o lipogénesis21, también aumentaron significativamente, mientras que los niveles de ARNm de perilipina (Plin), que controlan la lipólisis , se redujeron significativamente (Fig. 3H) en ratones End.LepR-KO. Por otro lado, los niveles de ARNm de leptina no difirieron significativamente (Fig. 3I). Cabe destacar que Fabp4 también se expresa en células endoteliales microvasculares involucradas en el transporte de ácidos grasos dentro del tejido adiposo22. En este sentido, los niveles de ARNm de Fabp4 no difirieron significativamente entre las células endoteliales aisladas de VAT de ratones End.LepR-WT y -KO (P = 0,616; n = 5 réplicas biológicas por grupo; no se muestra). En línea con la diferenciación mejorada de adipocitos, los niveles de ARNm del factor 1 de preadipocitos (Pref1, también conocido como Dlk1) se redujeron significativamente en ratones End.LepR-KO (Fig. 3J), mientras que los niveles de ARNm del factor de crecimiento alfa derivado de plaquetas (Pdgfra ; Fig. 3K), un marcador de fibroblastos y células precursoras de adipocitos23, o marcadores de proliferación celular, como la ciclina D1 (Ccnd1; Fig. 3L) o el antígeno nuclear de proliferación celular (Pcna; no se muestra) no diferían significativamente.

Adiposidad visceral, hiperleptinemia y expresión de genes adipogénicos. Pesos de tejido adiposo visceral (VAT) (A) y niveles de leptina sérica (B) en ratones machos y hembras End.LepR-WT y End.LepR-KO alimentados con una dieta rica en grasas (HFD) durante 16 semanas. Los datos se compararon mediante la prueba de Kruskal-Wallis, la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. *p < 0,05, ***p < 0,001 y ****p < 0,0001. ns, no significativo. El análisis ANOVA de dos vías mostró una interacción significativa sexo por eliminación (p = 0,0152 en A, p = 0,0024 en B). (C) Imágenes microscópicas representativas de secciones de tejido VAT incluidas en parafina y teñidas con H&E de ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO. Las barras de escala representan 200 µm. Los resultados del análisis morfométrico del área media de adipocitos se muestran en (D). Los datos se compararon usando ANOVA de una vía, la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. **p < 0,01 y ****p < 0,0001. El análisis ANOVA de dos vías mostró una interacción significativa sexo por eliminación (p = 0,0117). Expresión relativa de ARNm de proteína 4 de unión a ácidos grasos (Fabp4; E), receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas (Pparg; F), catenina beta-1 (Ctnnb1; G), perilipina-1 (Plin; H), leptina ( Lep; I), factor de preadipocitos 1 (Pref-1; J), factor de crecimiento derivado de plaquetas alfa (Pdgfra; K) y ciclina D1 (Ccnd1; L) en VAT de ratones hembra End.LepR-KO (n = 12) después de 16 semanas de DFH. Los datos se notifican como expresión génica en relación con ratones compañeros de camada End.LepR-WT hembra (n = 9) usando el método ΔΔCt después de la normalización a la expresión del gen de referencia (RPLO). Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student (F, H) o la prueba de Mann-Whitney (E, G). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y ****p < 0,0001.

Con respecto a las diferencias en el grado de inflamación del VAT asociado con la obesidad, la citometría de flujo reveló un número significativamente mayor de monocitos inflamatorios CD45+ Lin− CD11b+ Ly6Chigh CXCR1+ MHCII− (Fig. 4A,B) y monocitos CD45+ Lin− CD11b− CD11c+ MHCII+ (Fig. 4C, D) en VAT de ratones End.LepR-KO en comparación con controles End.LepR-WT. La inmunohistoquímica confirmó un mayor número de macrófagos positivos para Mac2 (Fig. 4E, F), organizados como estructuras en forma de corona (CLS; Fig. 4G) o fusionados con células gigantes multinucleadas (MGS; Fig. 4H)24. El número total de células endoteliales inmunopositivas para CD31 en VAT no difirió entre los ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO (suplemento Fig. 1A, B). Como resultado del área media de adipocitos más grande, se redujo significativamente el número de adipocitos por campo de microscopio (P = 0,0077 frente a End.LepR-WT en mujeres; P = 0,8359 frente a End.LepR-WT en hombres; datos no mostrados ), el número relativo de células inmunopositivas para CD31 por adipocito aumentó significativamente en los ratones hembra End.LepR-KO (Supl. Fig. 1C). Los niveles de ARN mensajero de los marcadores de activación de células endoteliales no difirieron significativamente entre las células endoteliales de los ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO (suplemento Fig. 2A-C).

Inflamación del tejido adiposo visceral. Los subconjuntos de células inmunitarias se analizaron en homogeneizados de tejido adiposo visceral (VAT) de ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO alimentados con una dieta rica en grasas (HFD) durante 16 semanas mediante citometría de flujo. Gráficos de puntos representativos después del análisis de MHC-II y Ly6C se muestran en (A), de CD11c y MHC11 en (C), los resultados del análisis cuantitativo de células CD45+ Lin− CD11b+ Ly6Chigh CXCR1+ MHCII− en (B) y de CD45+ Lin− CD11b− CD11c+ MHCII− en (D), respectivamente. Los datos se expresan como % del total de células vivas en VAT y se compararon usando ANOVA unidireccional, la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,005. (E) Imágenes representativas después del análisis inmunohistoquímico de macrófagos en VAT de ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO alimentados con HFD durante 16 semanas. Las barras de escala representan 100 μm. Los resultados del análisis cuantitativo del área inmunopositiva para Mac2 se muestran en (F), el número de estructuras en forma de corona (CLS) o células gigantes nucleadas por 100 adipocitos se muestran en (G) y (H), respectivamente. Los datos se analizaron usando la prueba t de Student. *p < 0,05 y **p < 0,01.

La obesidad y la inflamación crónica (tejido adiposo) a menudo se complican con alteraciones metabólicas, como la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus. En este sentido, el análisis de los niveles séricos de glucosa e insulina en ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO en ayunas durante seis horas no reveló diferencias en la glucosa sérica (Suppl. Fig. 3A) o la insulina sérica (Suppl. Fig. 3B) niveles. Las pruebas de tolerancia a la glucosa no confirmaron diferencias significativas en los ratones alimentados con SD (Suplemento Fig. 3C) o HFD durante 16 semanas (Suplemento Fig. 3D), aunque en este último se observó una tendencia hacia una eliminación de glucosa más rápida. Además, el peso medio del hígado no difirió entre los ratones End.LepR-WT y -KO (Supl. Fig. 4A), y el análisis histológico de las secciones transversales crioincrustadas después de la tinción con Oil red O reveló cantidades similares de lípidos neutros almacenados (Suplemento Fig. 4B,C).

Para examinar si las diferencias en el consumo diario de alimentos, el gasto de energía o la actividad física han contribuido a la obesidad más pronunciada en los ratones End.LepR-KO, se empleó calorimetría indirecta. Se observaron ratones compañeros de camada machos y hembras individuales durante 1 semana en SD seguido de 1 semana de observación en HFD (n = 3 experimentos independientes; n = 12 repeticiones biológicas). Los ratones End.LepR-KO exhibieron un mayor consumo total de alimentos (Fig. 5A-D) y un balance total de energía (Fig. 5E, F). Por otro lado, la actividad física diaria, medida como locomoción peatonal (no mostrada), actividad locomotora (Supl. Fig. 5A,B) o distancia total en locomoción en jaula (Supl. Fig. 5C,D), no difirió significativamente. El consumo de oxígeno (VO2; Supl. Fig. 6A,B), la producción de dióxido de carbono (VCO2; Supl. Fig. 6C,D) y las tasas de intercambio respiratorio (Supl. Fig. 6E,F) también fueron similares, lo que indica una oxidación inalterada de la energía. sustratos en ratones End.LepR-KO.

Consumo total de alimentos, balance energético y transporte de leptina exógena al cerebro. Gráfico de tiempo de ingesta total de alimentos de ratones macho (A) y hembra (C) End.LepR-WT y End.LepR-KO (n = 3 por grupo) registrados en jaulas metabólicas en ciclos repetidos de 12 h día-noche. Los ratones fueron alimentados con una dieta de laboratorio estándar (SD) durante 7 días, seguido de un cambio a una dieta alta en grasas (HFD) durante 7 días adicionales. Resumen del total de alimentos consumidos durante 14 días para ratones macho (B) y hembra (D) End.LepR-WT y End.LepR-KO. Gráfico de tiempo del balance de energía total antes y después del cambio de dieta de SD a HFD en ratones macho (E) y hembra (F) End.LepR-WT y End.LepR-KO. (G) Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de secciones de cerebro incrustadas criogénicamente de ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO, inyectados ip con leptina marcada con rodamina (roja) e inyectados ic con lectina marcada con FITC para visualizar células endoteliales ( verde) inmunoteñida para LepR (magenta). Los núcleos de las células positivas para DAPI son azules. (H) Resumen del análisis cuantitativo del área positiva de rodamina leptina por área total de 40 × campos microscópicos. **p = 0,01, determinado mediante la prueba t de Student.

La detección de los niveles circulantes de la hormona de la saciedad leptina requiere su unión a los receptores de leptina expresados en las células de la barrera hematoencefálica seguido de transcitosis25,26,27. El análisis de microscopía de fluorescencia demostró la unión de la leptina recombinante exógena marcada con rodamina a las células endoteliales que recubren la eminencia media y en todo el cerebro en ratones End.LepR-WT, mientras que se detectaron señales bajas de leptina administrada exógenamente en el cerebro de End.LepR- ratones KO. Los ejemplos representativos se muestran en la Fig. 5G, los resultados del análisis cuantitativo en la Fig. 5H. Estos hallazgos sugirieron que la obesidad más pronunciada y la mayor ingesta de alimentos observada en ratones que carecen de LepR endotelial se han producido como consecuencia de una transcitosis alterada del factor de saciedad a través de la barrera hematoencefálica. El análisis de las secciones de tejido VAT reveló hallazgos similares, es decir, leptina marcada con rodamina significativamente reducida en ratones End.LepR-KO (suplemento Fig. 7A, B).

Para estudiar más a fondo el papel de LepR en las células endoteliales para el control del peso corporal, más allá de la regulación de la transcitosis de leptina, se aislaron células endoteliales primarias del cerebro y VAT de ratones End.LepR-KO y End.LepR-WT y sus perfiles bioenergéticos. examinado en tiempo real. Sin embargo, la tasa de acidificación extracelular (ECAR; un indicador de la glucólisis) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR; un indicador de la respiración mitocondrial) no difirieron significativamente entre las células endoteliales aisladas del cerebro de los ratones End.LepR-WT y -KO, ni en ratones alimentados con SD ni en aquellos alimentados con HFD (Fig. 6A, B; los datos sin procesar se muestran en la Supl. Fig. 8A, B). ECAR y OCR también fueron similares en las células endoteliales aisladas de VAT de ratones End.LepR-KO en comparación con los controles End.LepR-WT (Fig. 6C, D; los datos sin procesar se muestran en Supl. Fig. 8C, D).

Inflamación cerebral y perfiles energéticos del cerebro primario y células endoteliales del VAT. Resumen de los resultados tras el análisis de la glucólisis y la respiración mitocondrial en células endoteliales primarias vivas aisladas del cerebro (A,B) o tejido adiposo visceral (VAT; C,D) de hembras End.LepR-WT (n = 4–5) y End .LepR-KO (n = 7) ratones alimentados con dieta estándar de laboratorio (SD) o dieta alta en grasas (HFD) durante 16 semanas. Los análisis se realizaron utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse XF96e. Los resultados se normalizaron con respecto al número de células y se expresan como cambio de veces frente a ratones End.LepR-WT. Los datos se analizaron utilizando ANOVA de una vía, la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Ns, no significativo. Imágenes representativas de inmunofluorescencia de secciones de cerebro crioincrustadas de ratones End.LepR-WT (n = 7–8) y End.LepR-KO (n = 7), alimentados con una dieta rica en grasas durante 16 semanas, después de teñirlos con anticuerpos contra CD206 (verde) y CD31 (rojo) (E) o contra Mac2 (verde) y VEGF (rojo) (H). Las barras de tamaño representan 20 µm. Resultados tras la cuantificación del área inmunopositiva para CD206 (F), CD31 (G), Mac2 (I) o VEGF (J), expresada por área total de 40 × campos microscópicos. Los datos se analizaron usando la prueba t de Student. *p < 0,05 y **p < 0,01.

Estudios previos sugirieron un papel de las citocinas derivadas de células inflamatorias en el mantenimiento del metabolismo de las células endoteliales en la obesidad28. El análisis de microscopía de inmunofluorescencia de secciones del cerebro mostró que la alimentación HFD se asoció con un alto número de células inflamatorias, similar al VAT. Específicamente, la cantidad de células inmunopositivas para CD206 en la vecindad de las células endoteliales inmunopositivas para CD31 (Fig. 6E-G), así como la cantidad de macrófagos inmunopositivos para Mac2 que expresan VEGF (Fig. 6H-J) fue mayor en End.LepR -Ratones KO comparados con ratones End.LepR-WT.

En contraste con los hallazgos en el cerebro y el VAT, las tasas de producción de ATP glucolítico y mitocondrial aumentaron significativamente en las células endoteliales aisladas del pulmón de ratones End.LepR-KO, independientemente de la dieta (Fig. 7A-D). Sin embargo, el análisis qPCR de los niveles de ARNm de los transportadores de glucosa (es decir, Glut1; Fig. 7E) o enzimas glucolíticas (es decir, Hk2, Pfkb3; no se muestran), así como marcadores mitocondriales (es decir, Idh; Fig. 7F), reguladores de la función mitocondrial (es decir, Sirt3; Fig. 7G) o activadores de la biogénesis mitocondrial (es decir, Pcg1α; no se muestra) no difirieron significativamente entre las EC primarias aisladas de los pulmones de ratones End.LepR-WT y -KO, lo que sugiere vías alternativas de activación metabólica.

Metabolismo energético y expresión de enzimas glucolíticas o marcadores mitocondriales en células endoteliales de pulmón primario. Ejemplos representativos de la tasa de acidificación extracelular (ECAR; A) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR; B) en células endoteliales primarias vivas aisladas de hembras End.LepR-WT (n = 7) y End.LepR-KO (n = 7 ) ratones alimentados con dieta estándar. Los datos se analizaron utilizando ANOVA bidireccional, las pruebas de comparación múltiple de Sidak. *p < 0,05 y **p < 0,01 frente a ratones End.LepR-WT en el mismo momento. No se muestran diferencias no significativas. El resumen de los hallazgos de n = 4 experimentos independientes que miden el ECAR (C) o el OCR (D) para determinar la glucólisis o la respiración mitocondrial en ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO alimentados con una dieta estándar (SD) o con un alto contenido de grasas. dieta (HFD). Los resultados se normalizaron con respecto al número de células y se expresan como cambio de veces frente a ratones End.LepR-WT. Los datos se compararon utilizando ANOVA de una vía, las pruebas de comparación múltiple de Sidak. *p < 0,05, **p < 0,01 y ****p < 0,0001 frente a ratones End.LepR-WT. Análisis PCR cuantitativo en tiempo real de Glut1 (E), Idh (F) y Sirt3 (G) en células endoteliales de pulmón primario de ratones hembra End.LepR-WT y End.LepR-KO (n = 10 por grupo). Los datos se compararon utilizando la prueba t de Student. Ns no significativo.

La adipocina leptina controla el peso corporal y el gasto energético, principalmente actuando sobre los LepR en las células neuronales29. Los receptores de leptina se expresan en muchos tipos de células diferentes en todo el cuerpo30. Aquí, mostramos que los receptores de leptina en las células endoteliales participan en la regulación de la ingesta de alimentos y el peso corporal e identificamos el transporte reducido de leptina a través de la barrera hematoencefálica como un mecanismo potencial. Los niveles elevados de leptina circulante a pesar del aumento del peso corporal confirmaron la presencia de resistencia a la leptina en ratones que carecían de receptores de leptina endoteliales. Otras consecuencias indirectas del aumento de peso corporal también fueron más pronunciadas, como la inflamación del VAT y la expresión de genes adipogénicos, mientras que la glucosa sérica o la insulina, el metabolismo corporal total o los niveles de actividad física no se vieron alterados. Los cambios observados fueron moderados y medibles solo en ratones con dieta obesogénica, lo que sugiere que los LepR endoteliales no están involucrados causalmente en el desarrollo de la obesidad, sino que juegan un papel modificador.

La regulación del peso corporal y la homeostasis energética es un proceso complejo, que se controla en el sistema nervioso central ya nivel de los órganos periféricos, incluidos el tejido adiposo, el músculo esquelético y el hígado31. El papel de la leptina y sus receptores en el control de la ingesta de alimentos y el gasto de energía se sugirió hace varios años por los hallazgos de obesidad severa en ratones ob/ob con deficiencia de leptina o en ratones db/db que expresaban LepR mutados no funcionales en todas las células. a través del cuerpo. Subrayando el papel principal de los receptores de leptina en las células neuronales en la homeostasis del peso corporal, la eliminación genética selectiva de LepR en todas las neuronas (usando sinapsina I-Cre)32 o poblaciones de células neuronales definidas, como las que expresan el péptido relacionado con agutí33, pero no en los hepatocitos32 , causó obesidad severa y diabetes, y el fenotipo de los ratones db/db podría ser rescatado por la reexpresión neuronal de los receptores de leptina34,35. Aunque se demostró que la presencia de LepR en las células neuronales es "necesaria y suficiente"36, también se ha informado sobre el papel de los receptores de leptina en las células no neuronales en el control del peso corporal37. Estudios previos de ablación genética y farmacológica en ratones identificaron que la señalización de leptina en astrocitos38,39 o precursores de oligodendrocitos/células gliales40 desempeña un papel en el mantenimiento de una homeostasis energética normal. Otras células que expresan LepR en el cerebro, como las perivasculares41,42 o las células endoteliales5,43, también se han implicado en el control del peso corporal por parte del sistema nervioso central al actuar como mediadores de la captación de leptina. La eliminación genética de LepR usando Slco1c1 (Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1C1), un receptor transmembrana expresado en las células endoteliales de los capilares cerebrales44, como conductor de Cre reveló que el transporte de leptina marcada radiactivamente hacia el hipotálamo se redujo en aproximadamente un 40 %36. Aunque no se observó respuesta a la leptina exógena, el aumento de peso corporal monitoreado durante 3 meses se vio afectado solo en ratones alimentados con HFD36, similar a nuestros hallazgos. También se observaron niveles de leptina en plasma y peso corporal ligeramente aumentados en ratones alimentados con HFD con eliminación global de isoformas cortas de LepR45. Aunque la expresión endotelial de ambas isoformas de LepR se redujo en nuestro estudio, estos hallazgos sugieren que la ausencia de la isoforma corta de LepR, es decir, la isoforma ampliamente expresada en las células periféricas46, puede haber sido suficiente47.

Los receptores de leptina se expresan en las células endoteliales de todo el cuerpo48. Para examinar su función, estudios previos utilizaron ratones que expresaban constitutivamente LepR truncados unidos a la membrana en células que expresan Tie26,8, es decir, células endoteliales pero también células hematopoyéticas. Estos llamados ratones ELKO estaban parcialmente protegidos de la obesidad y exhibieron un fenotipo metabólico moderadamente mejorado en respuesta a HFD a pesar de los niveles elevados de leptina en sangre8. A diferencia de estos informes anteriores, en el presente estudio se examinaron ratones en los que el primer exón estaba flanqueado por secuencias loxP para eliminar completamente LepR después de la recombinación Cre32, y se indujo la actividad de la recombinasa Cre en ratones adultos para apuntar selectivamente al endotelio que expresa Tie2, y no células hematopoyéticas49. Por lo tanto, la DFH también se inició más tarde, y no a las 6 semanas de edad8, evitando así el aumento de peso que normalmente ocurre durante el crecimiento.

La obesidad en los seres humanos se produce como resultado de un desequilibrio entre la ingesta y el gasto de energía, posiblemente como consecuencia de la alteración de la señalización de leptina en presencia de niveles elevados de leptina circulante. La calorimetría indirecta demostró diferencias significativas en la ingesta de alimentos y el balance energético total en ratones End.LepR-KO alimentados con HFD, en línea con los niveles bajos de leptina 'percibidos' después de la eliminación endotelial de LepR y un transporte deficiente de leptina a través de la barrera hematoencefálica, uno de los los mecanismos subyacentes al desarrollo de la resistencia a la leptina en la obesidad50. Es de destacar que el transporte de leptina a través de la barrera hematoencefálica no se vio alterado en ratones que expresan una forma truncada de LepR en células que expresan Tie2 o astrocitos7. Algunos estudios sugirieron que el transporte de leptina a través de la barrera hematoencefálica estaba intacto en ratones obesos51 o que la leptina podría llegar al cerebro a través del transporte directo a través de los órganos circunventriculares52. Se ha sugerido que los tanicitos, un tipo de células gliales especializadas que recubren el piso del tercer ventrículo, median el transporte de la leptina administrada periféricamente al cerebro53, y la eliminación específica de tanicitos de los LepR causó hiperleptinemia y aumentó el aumento de peso corporal54, aunque otros laboratorios encontraron leptina -cambios inducidos en la señalización de STAT3 hipotalámico para no depender de tanicitos55. Cabe destacar que el transporte de leptina a través de la barrera hematoencefálica no solo depende de los LepR, sino también de su interacción con otros receptores, como el EGFR, o de la unión de la leptina a otros receptores, como megalin/LRP256,57. Aunque se ha demostrado que la afinidad de la leptina para unirse a esos receptores es mucho menor que para LepR58, estos mecanismos pueden volverse relevantes en estados de hiperleptinemia.

En línea con el desarrollo de resistencia (funcional) a la leptina en ratones End.LepR-KO, la obesidad se asoció con niveles elevados de leptina. Aunque los niveles de expresión de ARNm de leptina no difirieron entre los ratones VAT de End.LepR-WT y End.LepR-KO, lo que corrobora los hallazgos en ratones ELKO6, un mayor número de células grasas productoras de leptina puede haber contribuido a esta observación. Además de ser una consecuencia del aumento de la masa de tejido adiposo, los niveles elevados de leptina pueden haberse desarrollado como consecuencia de la reducción de la captación endotelial de LepR en el cerebro u otros órganos6. Con respecto a nuestra observación de aumento de la adiposidad visceral e hiperleptinemia principalmente en ratones hembra, les atribuimos el hecho de que la HFD se inició relativamente tarde en la vida, y que las diferencias en estos parámetros pueden no haber sido detectables en los ratones machos que ya eran más pesados. Estudios previos de hibridación in situ no revelaron diferencias en la expresión de LepR en el núcleo arqueado, el núcleo ventromedial, el tálamo y la corteza piriforme entre ratas macho y hembra, aunque la expresión del gen LepR disminuyó en respuesta a la administración de estradiol y aumentó después de la ovarectomía59.

Con respecto al papel de los receptores de leptina en las células endoteliales más allá del control del transporte de leptina a los centros neuronales de control del peso corporal, hemos demostrado que la eliminación genética inducible de los receptores de leptina endoteliales en ratones o la regulación a la baja mediada por ARNip de los receptores de leptina en células endoteliales humanas conduce a la autofagia de las células endoteliales cardíacas, similar a la inhibición de mTOR o la inanición celular17. En el presente estudio, los cambios metabólicos en las células endoteliales se observaron solo en aquellas aisladas de órganos periféricos que no se sabe que estén involucrados en el control del peso corporal, como los pulmones, mientras que el manejo del sustrato energético no se vio alterado en las aisladas de cerebro y VAT. Los factores producidos en las células inflamatorias pueden haber preservado las funciones metabólicas endoteliales y actuar como un mecanismo protector, como se demostró recientemente para los macrófagos perivasculares productores de VEGF en el cerebro de ratones obesos28. El análisis de secuenciación de células individuales mostró recientemente diferencias específicas de órganos en la susceptibilidad a la obesidad60, lo que también puede haber influido, aunque esto no pudo examinarse en el presente estudio. Además, la ausencia de LepR en las células endoteliales puede haber afectado el metabolismo adiposo al alterar la inervación grasa simpática61 o los mediadores angiocrinos62.

En conjunto, nuestros hallazgos respaldan el papel de los LepR endoteliales en la mediación del transporte de leptina al cerebro y el control neuronal de la ingesta de alimentos, pero no en el metabolismo energético de todo el cuerpo, mientras que la producción de energía en las células endoteliales se alteró de manera específica de órgano. .

La generación de ratones con deleción de LepR mediada por Tie2.Cre-ERT2 inducible por tamoxifeno en células endoteliales se describió previamente12,17. Para la activación de la recombinasa Cre, se alimentó a los ratones (6 semanas de edad) con comida para roedores que contenía citrato de tamoxifeno (Envigo; TD.130860) durante 6 semanas49. El ADN genómico de cerebro, pulmón, intestino delgado, tejido adiposo subcutáneo (SCAT) y tejido adiposo visceral (VAT) se aisló utilizando el reactivo de lisis de PCR directa (Peqlab) que contenía 0,2 mg/ml de proteinasa K (Peqlab). El genotipo del ratón se determinó utilizando los siguientes cebadores: Tie2.Cre (Tie2Cre1: 5′-CGA GTG ATG AGG TTC GCA AG-3′; Tie2Cre2: 5′-TGA GTG AAC GAA CCT GGT CG-3′); LepR (LepRflox1: 5′-GTC ACC TAG GTT AAT GTA TTC-3′; LepRflox2: 5′-TCT AGC CCT CCA GCA CTG GAC-3′. La eliminación del gen LepR inducida por tamoxifeno se confirmó usando los cebadores: LepRflox1: 5 ′-GTC ACC TAG GTT AAT GTA TTC-3′ y LepR delta/∆: 5′-GCA ATT CAT ATC AAA ACG CC-3′). Se usaron ratones Tie2.ERT2-WT LepRflox/flox del mismo sexo, alimentados con una dieta para roedores que contenía tamoxifeno, como controles a lo largo de todo el estudio.

Después de la dieta con tamoxifeno, los ratones machos y hembras compañeros de camada recibieron una dieta de laboratorio estándar (SD) para ratones (V1124-300; ssniff®) durante 2 semanas y luego cambiaron a 45 kcal-% HFD (D12451; Research Diets) ad libitum para inducir la obesidad. . El peso corporal se determinó antes y cada 4 semanas durante un total de 16 semanas. Todos los procedimientos experimentales con animales habían sido aprobados a priori por el comité de ética animal local (Centro de Investigación Animal Traslacional, Centro Médico Universitario de Mainz) y el Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz (permiso de animales G16-1-081) y cumplían con las pautas nacionales para el cuidado. y uso de animales de laboratorio. El estudio se informa de acuerdo con las directrices ARRIVE.

Para medir de forma continua y simultánea el gasto de energía, la actividad física, el consumo de O2 y la producción de CO2, así como la ingesta de alimentos y agua, se transfirió un subconjunto de ratones en SD a jaulas metabólicas (Promethion High-Definition Multiplexed Respirometry Cage; Sable Systems™). Cada jaula estaba revestida con chips de Aspen, una tolva de comida y una botella de agua conectada a un sistema de monitoreo de ingesta de agua/alimento integrado en la tapa de la jaula. La actividad física se monitoreó en tiempo real utilizando el sistema de monitoreo de actividad de rotura de haz BXYZ. Después de un período de equilibrio de 5 días a las condiciones estándar de alojamiento de los animales, los parámetros metabólicos se registraron durante 7 días en SD seguido de 45% HFD durante 7 días adicionales. La temperatura se mantuvo constante a 22 °C, y las luces se encendieron y apagaron a las 6:00 y 18:00 h respectivamente, para mantener ciclos de luz-oscuridad de 12 h y correlacionar los patrones de actividad con los ciclos circadianos. Por cada experimento (n = 3 réplicas experimentales), se estudiaron End.LepR-WT y End.LepR-KO (n = 4 ratones por experimento). La herramienta web CalR se utilizó para analizar los datos brutos de calorimetría indirecta para generar gráficos y análisis estadísticos. Los parámetros metabólicos se normalizaron al peso corporal individual respectivo de los ratones registrado al comienzo de la etapa de equilibrio63.

En subconjuntos de ratones compañeros de camada, se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa después de haber sido alimentados con SD o HFD durante 14 semanas. Tras la retirada del alimento durante 6 h (con agua de bebida ad libitum), tal y como se recomienda para los estudios metabólicos en ratones64, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal una solución de glucosa al 20% a una dosis de 2 g/kg de peso corporal (volumen de inyección de glucosa ip (μL) = 10 × peso corporal (g)), y los niveles de glucosa en sangre (vena de la cola) se determinaron antes y 15, 30, 60 y 120 minutos después de la administración de glucosa utilizando el sistema de control de glucosa en sangre CONTOUR® NEXT (Ascensia Diabetes Care Valores en cartera).

Después de 16 semanas de HFD, los ratones se anestesiaron profundamente (usando una mezcla de clorhidrato de ketamina [75 mg/kg de peso corporal] y clorhidrato de xilazina [15 mg/kg de peso corporal] en una solución de cloruro de sodio al 0,9 %) y se extrajo sangre completa. por punción cardíaca para medir los niveles de glucosa en ayunas, como se indicó anteriormente. El resto se dejó coagular durante 30 min a temperatura ambiente y luego se preparó el suero. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical bajo anestesia profunda. Su cerebro, tejido adiposo perigonadal visceral (VAT) e hígado se extrajeron, pesaron y prepararon para análisis moleculares o histológicos posteriores, o aislamiento de células endoteliales. En algunos ratones, se inyectó leptina marcada con rodamina (FR-003-13, Phoenix Pharmaceuticals; 5 mg/kg de peso corporal) 45 min antes de la recolección del tejido mediante inyección intraperitoneal (ip). Luego, se inyectó intracardiacamente (ic) lectina I marcada con fluoresceína de Griffonia Simplicifolia (FL-1201, Vector Laboratories) 15 minutos antes de la recolección del tejido para marcar vasos sanguíneos funcionales y células microgliales in vivo. Los tejidos se prepararon para crioconservación y análisis de microscopía de fluorescencia.

El suero se preparó por centrifugación a 3000 rpm durante 10 min y se almacenó a -80 °C pendiente de análisis. La glucosa sérica en ayunas se midió utilizando ensayos colorimétricos (BioAssay Systems). Se emplearon inmunoensayos ligados a enzimas comerciales para determinar los niveles circulantes de leptina murina (R&D Systems Inc; rango de detección: 1.58–5.56 pg/mL), receptor de leptina soluble (sLepR; anticuerpos en línea, ABIN773812) o insulina (Crystal Chem, #90060; rango de detección: 0,1–12,8 ng/mL), según las instrucciones del fabricante.

Para la preparación de secciones de tejido e histología incluidas en parafina, una parte de VAT se fijó durante la noche en formalina de zinc al 4 % (Sigma), seguida de incubación en etanol al 70 % (Carl Roth) y se incluyó en parafina (Surgipath® Paraplast; Leica Biosystems) . Se desparafinizaron secciones transversales en serie de cinco µm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para medir el área de un solo adipocito. Para la inmunohistoquímica, las secciones desparafinadas se lavaron en una serie de alcohol graduado seguido de recuperación de antígeno inducida por calor (en tampón de citrato 0,01 M, pH 6,0 durante 6 min) antes del bloqueo con suero normal al 10 % (abcam). Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo monoclonal de rata primario contra Mac2 (CL8942AP; Cedarlane Laboratories; dilución, 1:400 en diluyente de anticuerpos (Dako)). Para la detección, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario (dilución: 1:1000; Molecular Probes) seguido de complejo de avidina-biotina (Vector Laboratories) y sustrato de aminoetil carbazol (abcam) hasta el desarrollo del color. Las secciones se contrastaron brevemente con hematoxilina de Gill (Sigma), se montaron en ImmuMount (ThermoScientific) y se fotografiaron con un aumento de 20 × (microscopio Olympus BX51). Las inmunoseñales de Mac2 se cuantificaron como porcentaje del área total utilizando el software Image-Pro Plus (versión 7.0) (Media Cybernetics Inc.). Para la crioconservación y la preparación de criocortes, los tejidos se incluyeron inmediatamente en el compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura a través de Science Services GmbH). Para analizar la acumulación de lípidos en el hígado, se fijaron secciones criogénicas de ocho micrómetros de espesor en formaldehído al 4 % durante 15 min, se lavaron tres veces en 1 × PBS seguido de tinción con Oil red O (Sigma) al 0,5 % durante 1 h a temperatura ambiente. Los tejidos se lavaron, se contrastaron con hematoxilina y se fotografiaron con un aumento de 20x en un microscopio óptico invertido (Motic AE31, Motic).

Se determinó el área de un solo adipocito, como se describió previamente65. En resumen, secciones transversales de 5 µm de espesor a través de VAT se tiñeron con H&E y se fotografiaron con un aumento de 10 × utilizando un microscopio Olympus BX51. Se capturaron cinco imágenes representativas de cada sección transversal, y se seleccionaron y midieron al azar al menos 10 adipocitos por imagen utilizando el software de análisis de imágenes (Image-Pro Plus, versión 7.0). Los resultados se promediaron por ratón. El área Oil red O-positiva en secciones de hígado se determinó en 5 imágenes por cada animal y los resultados se promediaron por ratón.

Para el análisis de inmunofluorescencia, se procesaron secciones criogénicas de 8 µm de espesor, como se describe a continuación. Las secciones se descongelaron durante 5 min a temperatura ambiente y se lavaron (2 × 5 min) con 1 × PBS (pH 7,5) seguido de fijación en acetona helada (PanReac AppliChem) durante 10 min a -20 °C. Las secciones se lavaron y rehidrataron con 1 × PBS (3 × 5 min) y se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,05 % (en PBS; Roth) durante 10 min a 37 °C. El anticuerpo primario se diluyó en diluyente de anticuerpos (Dako) y las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-Mac2 (CL8942AP; Cedarlane Laboratories), anti-CD206 (ab64693; abcam), anti-VEGF (ABS82, Millipore), anti-LepR (AF498; R&D Systems) y anti-CD31 ( sc18916; Santa Cruz Biotecnología). Las secciones se lavaron con PBS, seguido de una incubación con el anticuerpo secundario en 1 × PBS durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los siguientes anticuerpos secundarios utilizados fueron: Alexa Fluor™ Plus 647 burro anti-cabra (A32849; Life Technologies), Alexa Fluor™ 488 cabra anti-rata (ab150157; abcam), Alexa Fluor™ 555 cabra anti-rata (ab150154; abcam) , Alexa Fluor™ Plus 488 cabra anti-conejo (A32731, Life Technologies) y Alexa Fluor™ Plus 555 cabra anti-conejo (A32732; Life Technologies). Los núcleos celulares se visualizaron usando 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma). Para excluir la inmunotinción no específica, las secciones se incubaron solo con anticuerpos secundarios. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (Keyence; BZ-X810) equipado con una lente de objetivo de 40 × y un software de imagen BZ-X800. Las inmunoseñales se cuantificaron utilizando el software Image-Pro Plus en al menos 5 imágenes por animal y los resultados se promediaron por ratón.

Se aislaron células endoteliales murinas primarias (mPEC) del cerebro, los pulmones y el VAT. Las células endoteliales primarias del cerebro y del IVA se aislaron utilizando el sistema de disociación de papaína (Worthington), de acuerdo con el protocolo proporcionado en la hoja de datos. Las células endoteliales murinas primarias de los pulmones de los ratones End.LepR-WT y End.LepR-KO se aislaron mediante clasificación celular magnética con microesferas CD31 de ratón (Miltenyi Biotec), como se describió anteriormente10. Las células se cultivaron en placas de cultivo celular recubiertas con gelatina al 0,1 % y se mantuvieron en medio de crecimiento de células endoteliales MV2 (PromoCell) hasta la confluencia. Las células se analizaron entre los pases 0 y 2.

Para estudiar la tasa de producción total de ATP a partir de la glucólisis y la respiración mitocondrial en células endoteliales vivas, se realizó el ensayo de tasa de ATP en tiempo real Seahorse XFp con el analizador de flujo extracelular Seahorse XF96e (Agilent Technologies). Un día antes de realizar el ensayo, las células endoteliales se sembraron en placas de cultivo celular de poliestireno XF96 (V3) recubiertas de gelatina (Agilent Technologies) y se cultivaron en medio MV2 (PromoCell). Después de 24 h, el medio se cambió a medio de ensayo XF (XF RPMI con HEPES 1 mM; Agilent Technologies; #103576-100), suplementado con piruvato 1 mM, l-glutamina 2 mM y glucosa 25 mM (todo Sigma-Aldrich), y células incubadas a 37 °C en un SpectraMax i3 (VWR; INCU-Line) utilizado como incubador sin CO2 durante 45 min, mientras se obtienen imágenes de campo claro de conducción para documentar la siembra homogénea de células. Después de la calibración y la inicialización del cartucho del sensor, se registraron tres mediciones de referencia, antes de la adición de cada compuesto, y tres mediciones de respuesta después de inyecciones secuenciales del inhibidor de la ATP sintasa oligomicina (1,5 μM) del puerto A, el inhibidor del complejo 1 rotenona ( 0,5 µM) y el inhibidor del complejo 3 antimicina A (0,5 µM), ambos del puerto B. Después de completar el ensayo, las células se tiñeron con BioTracker NIR694 Nuclear Dye (Sigma, #SCT118) y se contaron para la normalización usando SpectraMax MiniMax 300 Imaging Citómetro (Molecular Devices). Los núcleos celulares se identificaron automáticamente utilizando el software SoftMaxPro 6.5.1 al establecer el tamaño y el umbral para la identificación de objetos en el canal rojo. El análisis de datos se realizó utilizando el software Wave 2.6.3.5 (Agilent Technologies).

El ARN total se aisló de células endoteliales murinas primarias usando solución TRI Reagent® (Ambion), como se describió previamente10. Para aislar el ARN total del tejido adiposo, el VAT murino recién cosechado se cortó en pequeños trozos y se transfirió a un tubo libre de RNasa/DNasa de 2 ml que contenía 0,5 ml de reactivo TRI y se homogeneizó mecánicamente (homogeneizador Miccra) en hielo. El homogeneizado se centrifugó a 12.000 xg durante 15 min para eliminar la fracción lipídica de la superficie de la fase acuosa. A continuación, la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo de 1,5 ml seguido de los pasos posteriores de aislamiento de ARN de separación de fases usando 100 µl de cloroformo, se mezcló vigorosamente y se centrifugó a 12 000 xga 4 °C durante 15 min. La capa acuosa se transfirió a un tubo nuevo con 500 µL de alcohol isopropílico y se mezcló para precipitar el ARN. Después de 20 min de incubación en hielo, el ARN precipitado se centrifugó a 12 000 xga 4 °C durante 10 min. El sedimento de ARN se lavó dos veces con etanol al 75 % y se secó al aire antes de disolverlo en agua libre de ARNasa. La concentración y calidad del ARN aislado se comprobó mediante espectrometría (Nanodrop; Thermo Scientific). Se transcribió inversamente un μg de ARN total en ADNc usando transcriptasa inversa M-MLV (Promega) después del tratamiento con ADNasa (Sigma). La RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó con SYBR® Green (BioRad) y el sistema de detección de PCR en tiempo real CFXConnect (BioRad). Los resultados se cuantificaron utilizando el método ΔΔCt. Los valores de umbral (Ct) de los genes de interés primero se normalizaron a los valores de Ct de los genes de referencia para obtener valores de ΔCt (= gen Ct de interés − Ct del gen de referencia) usando actina (ACTA; para células endoteliales) o la subunidad P0 del tallo lateral de la proteína ribosómica (RPLP0; para tejido adiposo). Para comparar el patrón de expresión de los genes en los ratones End.LepR-KO con los ratones WT, se calcularon los valores de 2−ΔΔCt y se expresaron como cambio de veces en los ratones de tipo salvaje (= ΔCt de End.LepR-KO/ΔCt de End.LepR- peso). Las secuencias de cebadores utilizadas para la PCR en tiempo real fueron: isoforma corta de LepR: para—GAA GTC TCT CAT GAC CAC TAC AGA TGA y rev—TTG TTT CCC TCC ATC AAA ATG TAA; Isoforma larga de LepR: para GCA TGC AGA ATC AGT GAT ATT TGG y rev CAA GCT GTA TCG ACA CTG ATT TCT TC; proteína 4 de unión a ácidos grasos (Fabp4): para—GAT GCC TTT GTG GGA ACC TGG y rev—TTC ATC GAA TTC CAC GCC CAG; catenina beta-1 (Ctnnb1): para—TTA AAC TCC TGC ACC CAC CAT y rev—AGG GCA AGG TTT CGA ATC AA; Ccnd1; para—GTT CGT GGC CTC TAA GAT GAA GGA y rev—CAC TTG AGC TTG TTC ACC AGA AGC; perilipina-1 (Plin1): para—CTT TCT CGA CAC ACC ATG CAA ACC y rev—CCA CGT TAT CCG TAA CAC CCT TCA; leptina (Lep): para—GGA TCA GGT TTT GTG GTG CT y rev—TTG TGG CCC ATA AAG TCC TC; Pdgfra: para—TAT CCT CCC AAA CGA GAA TGA GA y rev—GTG GTT GTA GTA GCA AGT GTA CC; Pparg: para—CTCACAATGCCATCAGGTTT y rev—CTC TTG CAC GGC TTT CTA CGG; Pref1: para—CGT GAT CAA TGG TTC TCC CT y rev—AGG GGT ACA GCT GTT GGT TG; miembro transportador de glucosa 1 (Glut1): para—GCA GTT CGG CTA TAA CAC TGG y rev—GCG GTG GTT CCA TGT TTG ATT G; o isocitrato deshidrogenasa (Idh): para -GGA GAA GCC GGT AGT GGA GA y rev -GGT CTG GTC ACG GTT TGG A; o sirtuina-3 (Sirt3): para—ATC CCG GAC TTC AGA TCC CC y rev—CAA CAT GAA AAA GGG CTT GGG; Nos3: para—GAC CCT CAC CGC TAC AAC AT y rev—CTG GCC TTC TGC TCA TTT TC; Seleccione: para—ATG CCT CGC GCT TTC TCT C y rev—GTA GTC CCG CTG ACA GTA TGC; y Vcam1: para—CTT CAT CCC CAC CAT TGA AG y rev—TGA GCA GGT CAG GTT CAC AG.

El VAT recién cosechado se transfirió a PBS enfriado con hielo, se trituró y se digirió en una solución de colagenasa (1 mg/mL de colagenasa II en medio RPMI) a 37 °C durante 1 h con agitación constante (ThermoMixer® C; Eppendorf). Después de 1 h, el tejido se pasó a través de un filtro celular de 70 μm (greiner bio-one) para eliminar los restos celulares no digeridos y se lavó con tampón FACS (1% FBS, 2 mM EDTA en PBS) para recolectar los adipocitos. Se incubó un número igual de células durante 10 min con anticuerpo monoclonal (mAb) no marcado contra CD16/CD32 (eBioscience) para bloquear la unión mediada por el receptor Fc no específico. Los monocitos y los macrófagos se tiñeron durante 30 min con aloficocianina (APC)-eFluor-780 o anti-CD45 de ratón marcado con BV/11 y Fixable Viability Dye eFluor506, anti-CD11b de ratón marcado con APC, CD115 anti-ratón marcado con PE, PerCP -Ly6C anti-ratón marcado con Cy5.5, anti-CD11c de ratón marcado con BV650, F4/80 anti-ratón marcado con azul del Pacífico, CX3CR1 anti-ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína e histocompatibilidad mayor anti-ratón marcado con APC-Cy7 complejo (MHC) clase II. Las células T, las células B, las células NK y los leucocitos polimorfonucleares se excluyeron mediante tinción con anticuerpos anti-B220, anti-CD3, anti-NK1.1 y Ly6G marcados con PE-Cy7 (todos de BioLegend). Todas las mediciones de citometría de flujo se realizaron en un BD LSR II (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Se utilizó Flow Jo versión 10 para el análisis de datos.

Los datos cuantitativos se presentan como media ± desviación estándar. La distribución normal se examinó mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Las diferencias entre dos grupos se probaron mediante la prueba t de Student para medias no pareadas o la prueba de Mann-Whitney, si no se confirmaba la distribución normal. Si se compararon más de dos grupos, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak si los valores tenían una distribución normal, o la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn, si no. Para la comparación de dos grupos en diferentes momentos, se empleó ANOVA de dos vías. Se asumió significación estadística si P alcanzaba un valor < 0,05. Todos los análisis se realizaron con el software de análisis de datos GraphPad PRISM (versión 9.0 para Windows; GraphPad Software Inc.).

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Los autores desean agradecer a Marina Thielen y Michaela Moisch (Departamento de Cardiología, Centro Médico Universitario de Mainz, Alemania) por su excelente asistencia técnica. El estudio fue apoyado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHA 808/7-1 y SCHA808/15-1) y Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK Shared-Expertise [SE]-94). KS es investigador principal del DZHK (sitio Rin-Meno, Maguncia). KZ cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Red de Capacitación Innovadora Marie Skłodowska Curie "TICARDIO" (acuerdo de subvención No 813409).

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Departamento de Cardiología, Cardiología I, Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg Mainz, Mainz, Alemania

Rajinikanth Gogiraju, Astrid Hubert, Luisa Renner, Magdalena L. Bochenek y Katrin Schäfer

Centro de Trombosis y Hemostasia, Centro Médico Universitario de Mainz, Mainz, Alemania

Claudius Witzler, Fatemeh Shahneh, Magdalena L. Bochenek, Konstantinos Zifkos, Christian Becker y Madhusudhan Thati

Clínica de Dermatología, Clínica Universitaria Münster, Münster, Alemania

cristiano becker

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Concepción y diseño del estudio: RG, TM y KS; Adquisición y análisis de los datos: RG, CW, AH, MLB, KZ, FS y LR Redacción y edición del borrador del manuscrito original: RG, CB, TM y KS

Correspondencia a Katrin Schäfer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gogiraju, R., Witzler, C., Shahneh, F. et al. La eliminación de los receptores de leptina endoteliales en ratones promueve la obesidad inducida por la dieta. Informe científico 13, 8276 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35281-7

Descargar cita

Recibido: 19 enero 2023

Aceptado: 16 mayo 2023

Publicado: 22 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35281-7

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