Mejorar la escalabilidad de Wolbachia - Luciérnaga Resplandor Co., Ltd

Parásitos y vectores volumen 16, Número de artículo: 108 (2023) Citar este artículo

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La introgresión del endosimbionte bacteriano Wolbachia en las poblaciones de Aedes aegypti es un enfoque de control biológico que se utiliza para reducir la transmisión de arbovirus. Esto requiere la liberación masiva de mosquitos infectados con Wolbachia. Si bien las liberaciones se han realizado utilizando una variedad de técnicas, las liberaciones de huevos, utilizando cápsulas solubles en agua que contienen huevos de mosquitos y alimento para larvas, ofrecen un método atractivo debido a su potencial para reducir los requisitos de recursos en el sitio. Sin embargo, se requiere la optimización de este enfoque para garantizar que no haya un impacto perjudicial en la aptitud del mosquito y para promover la introgresión exitosa de Wolbachia.

Determinamos el impacto del tiempo y la temperatura de almacenamiento en Ae de tipo salvaje (WT) e infectadas con Wolbachia (cepas wMel o wAlbB). huevos de aegypti. Los huevos se almacenaron dentro de cápsulas durante 8 semanas a 18 °C o 22 °C y se determinaron la tasa de eclosión, la tasa de emergencia y la densidad de Wolbachia. A continuación, examinamos la calidad del huevo y la densidad de Wolbachia después de exponer los huevos a 4–40 °C para determinar cómo pueden verse afectados los huevos si se exponen a temperaturas extremas durante el envío.

La encapsulación de los huevos durante 8 semanas no afectó negativamente la viabilidad de los huevos ni la aparición de adultos resultante ni la densidad de Wolbachia en comparación con los controles. Cuando los huevos se expusieron a temperaturas entre 4 y 36 °C durante 48 h, se mantuvieron su viabilidad y la densidad de Wolbachia adulta resultante; sin embargo, ambos se redujeron significativamente cuando se expusieron a 40 °C.

Describimos los límites de tiempo y temperatura para mantener la viabilidad de Ae. huevos de aegypti cuando se encapsulan o se exponen a temperaturas extremas. Estos hallazgos podrían mejorar la eficiencia de las liberaciones masivas al proporcionar restricciones de transporte y almacenamiento para garantizar que solo se utilice material de alta calidad durante las liberaciones de campo.

El dengue, causado por el virus del dengue (DENV), es endémico en más de 100 países, con aproximadamente la mitad de la población mundial en riesgo de infección [1,2,3]. Aedes aegypti es el principal vector del DENV, así como del virus Zika (ZIKV), el virus chikungunya (CHIKV) y el virus de la fiebre amarilla [4, 5]. La prevalencia de estas enfermedades virales sigue aumentando debido a la expansión del hábitat de los vectores [6, 7] y al fracaso de las estrategias de prevención actuales, como los insecticidas [8].

En consecuencia, esto ha impulsado el desarrollo de varias estrategias novedosas de biocontrol durante la última década. Los métodos de supresión de poblaciones involucran la liberación de insectos machos esterilizados por exposición química, irradiación o modificación genética [9,10,11,12]. Luego, los machos estériles se aparean con las hembras salvajes para producir descendencia inviable, lo que reduce el tamaño de la población. Otra forma de evitar que las hembras produzcan descendencia es liberando machos incompatibles. Este método se ha desarrollado mediante la introducción de la bacteria endosimbiótica Wolbachia en Ae. aegypti. Cuando Ae. aegypti se transinfectan con Wolbachia, los espermatozoides masculinos se modifican reproductivamente de tal manera que cuando los machos se aparean con hembras salvajes, sus crías mueren [13,14,15,16]. Todas las tecnologías actuales de supresión de la población implican la liberación continua de machos que reducen la población con el tiempo. Alternativamente, Wolbachia se puede utilizar en un enfoque de introgresión de población. Cuando Ae. aegypti son portadores de Wolbachia, se reduce el potencial de transmisión de virus como DENV [14, 17, 18], ZIKV [19, 20], CHIKV [14, 19, 21] y el virus de la fiebre amarilla [21, 22]. Este enfoque implica la liberación de machos y hembras de Ae infectados con Wolbachia. aegypti. Si bien las hembras no infectadas con Wolbachia no producen huevos viables cuando se aparean con machos infectados con Wolbachia, las hembras infectadas con Wolbachia pueden rescatar esta letalidad, brindándoles una ventaja reproductiva. Wolbachia se hereda por vía materna de tal manera que, con el tiempo, Wolbachia se propaga entre la población, creando una población de mosquitos que es refractaria a la transmisión viral. Todos estos métodos de control biológico dependen de la liberación masiva de mosquitos que compiten con las poblaciones naturales. Por lo tanto, es de alta prioridad contar con las herramientas para implementar métodos de biocontrol que ofrezcan una solución a largo plazo, a una escala suficiente para abordar la importante distribución de virus transmitidos por mosquitos [23,24,25,26,27].

Para introducir mosquitos en la naturaleza, se han utilizado huevos, pupas o liberaciones de adultos. Los dispositivos de liberación de pupas mantienen las pupas en agua y brindan protección y sacarosa a los adultos emergidos. La liberación en la etapa de vida de la pupa es beneficiosa porque, a diferencia de las larvas, las pupas no requieren alimento [28, 29]. Sin embargo, lograr un desarrollo sincronizado en masa es muy difícil ya que la etapa de pupa solo dura aproximadamente 24 h. Las liberaciones de adultos generalmente involucran el empaque de adultos en tubos de plástico ventilados y su liberación manual desde un vehículo de movimiento lento (30–35 km/h) o a pie [30]. La liberación aérea de adultos se ha investigado en el contexto de la técnica de los insectos estériles e implica un mecanismo de liberación especializado que almacena hasta 50 000 mosquitos, mantiene temperaturas frías y dosifica y expulsa a los mosquitos cuando se le solicita [31,32,33]. Las liberaciones aéreas reducirían en gran medida los costos operativos; sin embargo, no son prácticos en todos los contextos geográficos y sociales, como ciertas condiciones climáticas y asentamientos informales, lo que significa que las liberaciones en el suelo siguen siendo importantes. Dado que la liberación de pupas y adultos en el suelo requiere recursos sustanciales para criar y empacar mosquitos, la liberación de huevos ofrece una alternativa atractiva. Liberación de Ae. aegypti implica la producción de huevos en una instalación in situ o en un centro regional y el envío a sitios donde los huevos se liberan en el campo en un recipiente de agua con suficiente alimento para larvas. Las liberaciones de huevos son aplicables a cualquier método de biocontrol que no requiera clasificación por sexo antes de la liberación en el campo, como el método de cápsulas Friendly™ de Oxitec, el impulso genético y otras liberaciones de mosquitos genéticamente modificados [34, 35]. Este método se ha utilizado con éxito para establecer Wolbachia en Ae. aegypti pobla el campo, por ejemplo, en partes de Queensland, Australia y Yogyakarta, Indonesia [36,37,38]. Sin embargo, dividir en alícuotas y distribuir huevos con alimento para larvas mientras se mantiene la viabilidad de los huevos es difícil en masa; por lo tanto, para mejorar el método de envasado y entrega de huevos, se ha desarrollado la encapsulación de huevos con alimento para larvas en cápsulas solubles en agua [39].

Encapsular huevos con alimento para larvas e incubarlos sin tiempo de almacenamiento no afecta la tasa de eclosión, la tasa de emergencia, la longitud del ala adulta o la densidad de Wolbachia [39]. Sin embargo, aún se desconoce el impacto del tiempo y la temperatura de almacenamiento prolongados en los huevos encapsulados. Los estudios han demostrado que cuando los huevos no encapsulados infectados con Wolbachia se almacenan durante largos períodos de tiempo, la viabilidad de los huevos disminuye más rápido que en los huevos libres de Wolbachia [40,41,42,43,44,45,46,47,48]. Además, se ha demostrado que las temperaturas de almacenamiento de huevos tanto bajas (< 14 °C) como altas (cíclicas de 22 a 30 °C) tienen un impacto negativo en la viabilidad de los huevos [48, 49]. Por lo tanto, es importante determinar si la encapsulación exacerba aún más este impacto ya qué temperaturas los huevos infectados con Wolbachia siguen siendo viables.

En este estudio, investigamos si el tiempo o la temperatura de almacenamiento afectan las medidas de aptitud de los huevos encapsulados y si los huevos infectados con Wolbachia (wMel y wAlbB, las cepas actuales que se utilizan en las liberaciones de campo [23, 50]) se ven afectados de manera diferente en comparación con los huevos WT. Luego examinamos el impacto de la exposición a temperaturas extremadamente altas y bajas en la viabilidad de los huevos y la densidad de Wolbachia para informar las estrategias adecuadas de transporte de huevos y gestión de riesgos. Informamos que el almacenamiento de huevos dentro de cápsulas no afecta negativamente la viabilidad de los huevos, las tasas de emergencia o la densidad de Wolbachia en comparación con el método de almacenamiento de control. Mostramos que, si bien la viabilidad de los huevos se mantiene bastante bien después de la exposición a temperaturas frías, las temperaturas > 40 °C pueden reducir la viabilidad de los huevos y la densidad de Wolbachia.

Se utilizaron tres cepas de mosquitos australianos a lo largo de este estudio: WT, Ae infectado con wMel y wAlbB. aegypti. El establecimiento de estas colonias ha sido previamente descrito por Flores et al. [51]. Antes del inicio de estos experimentos, las líneas wMel y wAlbB se retrocruzaron con mosquitos WT australianos (100% machos WT) durante tres generaciones más para reducir cualquier divergencia genética que pudiera haber ocurrido entre las cepas. Además, se produjo un retrocruzamiento parcial en cada generación subsiguiente con un 10 % de machos WT en cada generación. Los experimentos tuvieron lugar en las ocho generaciones inmediatas después de la finalización del retrocruzamiento completo. Las colonias se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio en un insectario climatizado a 26 °C, 70 % de humedad relativa (HR) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h:12 h.

La dieta de las larvas se preparó moliendo y mezclando minuciosamente 35 % de polvo de hígado de res (Now Foods, EE. UU.), 50 % de harina de atún (Ridley Aqua Feeds, Australia) y 15 % de levadura de cerveza (Now Foods, EE. UU.) como se describe por Puggioli et al. . [52]. La versión de dieta líquida se preparó mezclando componentes sólidos con agua de ósmosis inversa (OI) para formar una suspensión al 7,51 %. Los componentes de los alimentos se almacenaron a 4 °C. En condiciones estándar de crianza para generar huevos para experimentos, se usaron obleas de camarón (Tetra®, EE. UU.) y se almacenaron a temperatura ambiente.

Para cada experimento, se criaron mosquitos durante una generación para recolectar huevos frescos. Para hacer esto, los huevos se incubaron al vacío y 200 larvas se colocaron en 3 l de agua RO y se alimentaron diariamente con dieta larval líquida o obleas de camarón. Con > 50 % de pupación, cada contenedor se transfirió a una jaula de 24,5 × 24,5 × 24,5 cm o 20 × 20 × 30 cm y se proporcionó a los mosquitos adultos una solución de sacarosa (10 % de sacarosa, 0,4 % de ácido propiónico). Se ofreció una comida de sangre a las hembras adultas 5 a 6 días después de la emergencia a través de comederos artificiales. La sangre humana fue proporcionada por la Cruz Roja Australiana (Acuerdo de suministro 22-05VI-04) o voluntarios humanos (Permiso de ética de investigación humana de la Universidad de Monash 27690). Se proporcionaron vasos forrados con papel de filtro y medio llenos de agua para la oviposición; 96 h después de la alimentación con sangre, los sustratos de papel con huevos de mosquito se secaron presionando entre capas de toallas de papel y tela durante 2 h y luego se secaron lentamente durante el transcurso del día siguiente en bandejas poco profundas forradas con toallas de papel y se almacenaron a 26 °C. y 75 ± 5% HR.

Para preparar cápsulas de huevo, se contaron manualmente 150 huevos viables y se cepillaron suavemente del sustrato de papel en una cápsula de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) soluble en agua de tamaño 00 (The Capsule Guy, Australia) usando un pincel pequeño. Antes de la preparación de la cápsula, se realizaron pruebas de tasa de eclosión en huevos de todas las líneas de mosquitos para cuantificar con precisión el número de huevos viables por cápsula. A continuación, las cápsulas se cubrieron con 285 mg de alimento para larvas y 110 mg de carbón activado. Se usó carbón activado como relleno para asegurar que las cápsulas estuvieran completamente llenas. Para cada experimento, se prepararon cinco réplicas de cápsulas para cada condición y semana de eclosión. Se prepararon cápsulas de solo alimento y se usaron como alimento para larvas para grupos de control no encapsulados (es decir, huevos sobre sustrato de papel). Los huevos del grupo de control se prepararon cortando el sustrato de papel sobre el que se pusieron los huevos en grupos de aproximadamente 150 huevos viables.

Para todas las condiciones de almacenamiento, los huevos se mantuvieron a 75 ± 5 % de HR y 22 °C, a menos que se especifique lo contrario. En experimentos de temperatura, los huevos contenidos en cápsulas o sobre sustrato de papel se almacenaron a 18 °C o 22 °C. Para los experimentos con temperaturas extremas, los huevos sobre sustrato de papel (sin encapsular) se almacenaron a 4 °C, 12 °C, 26 °C, 36 °C o 40 °C. La temperatura y la humedad se controlaron almacenando los huevos dentro de una incubadora de laboratorio (Thermoline L + M) con una solución salina saturada y se rastrearon usando hygrochrons (iButton®).

Para determinar la tasa de eclosión de los huevos en cápsulas o en sustrato de papel con una cápsula alimenticia, se fotografiaron y cuantificaron de 150 a 200 huevos por grupo utilizando la herramienta de conteo de Adobe Photoshop y se sumergieron en vasos con 300 ml de agua RO. El número de larvas en un contenedor individual se contó 48 h después de la inmersión de los huevos. Las larvas se devolvieron a sus recipientes correspondientes después de contarlas y se les permitió desarrollarse hasta la edad adulta. La tasa de eclosión se calculó como el porcentaje de huevos que produjeron larvas por contenedor.

La tasa de emergencia se determinó 14 y 16 días después de la eclosión y se calculó como el porcentaje de larvas que emergieron como adultos por contenedor.

Seis días después de la emergencia, se recolectaron hembras adultas (24–40 hembras por grupo) y se colocaron individualmente en placas de 96 pocillos y se homogeneizaron en 50 μl de tampón de calabaza (Tris 10 mM, pH 8,2; EDTA 1 mM; NaCl 50 mM) suplementado con 25 μg/ml de proteinasa K (Bioline) y una perla de vidrio de 2 mm (Pacific Laboratory Products). Las muestras se clarificaron mediante centrifugación durante 3 min a 3000 rpm y luego se incubaron en un termociclador (5 min a 56 °C seguido de 5 min a 98 °C). Los homogeneizados de mosquitos se clarificaron nuevamente mediante centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos y luego los sobrenadantes se diluyeron diez veces usando tampón AE (Qiagen). La densidad relativa total de Wolbachia se estimó mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa triplex (qPCR). Las reacciones de qPCR se realizaron en un volumen total de 10 μl que contenía 5 μl de 2 mezclas de reacción LightCycler 480 Probes Master, cebadores 2,5 μM, 10 μM de cada sonda (proteína de superficie de Wolbachia [wsp], proteína ribosómica S17 [RpS17] y el dominio repetido de anquirina que contiene proteína (DEJ70_01140) en wAlbB [wAlbB141]) y 3 μl de homogeneizado de adulto diluido (1:10) (ver Archivo adicional 1: Tabla S1 para secuencias de sonda y cebador) [53, 54]. El ciclado se realizó con LightCycler 480 II (Roche) con un ciclo a 95 °C durante 5 min, seguido de 45 ciclos de amplificación de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 1 s. Para analizar los datos de qPCR, se calcularon las expresiones normalizadas (NE) utilizando el método delta Ct [55], NE = 2Cq (referencia)/2Cq (objetivo), donde RpS17 fue el gen de referencia y wsp o wAlbB141 el gen objetivo.

El análisis de datos se realizó con R v 1.4.1717 y se visualizó con GraphPad Prism v 9.2. La normalidad se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk y las suposiciones mediante gráficos de diagnóstico y gráficos de simulación de residuos [56]. Realizamos un modelo lineal generalizado (GLM), la prueba H de Kruskal-Wallis o la prueba U de Mann-Whitney (datos no paramétricos) [57,58,59]. El modelado fue seguido por ANOVA para comparar el efecto del tratamiento (datos paramétricos) [60]. Si se identificaron interacciones significativas, utilizamos el método de ajuste del valor P de Tukey para las comparaciones por pares [61]. Se realizaron dos réplicas biológicas para cada experimento y evaluamos si los datos de las réplicas eran significativamente diferentes entre sí para determinar si las réplicas se analizaron por separado o juntas. Fig. 1 y Archivo adicional 1: Figura S1 y Fig. 2 y Archivo adicional 1: Figura S2 se analizaron de forma independiente y las Figs. 3 y 4 son representativos de dos experimentos independientes analizados juntos que incluyen una variable replicada. Los resultados estadísticos se proporcionan en detalle en Archivo adicional 2: Conjunto de datos S1.

Encapsular los huevos para almacenarlos a 22 °C no exacerba los impactos en la viabilidad de los huevos, la aparición de adultos o la densidad de Wolbachia en comparación con los controles. Los huevos infectados con WT, wMel y wAlbB se empaquetaron en cápsulas solubles en agua con alimento para larvas o se dejaron en sustrato de papel como control y se almacenaron a 22 ° C durante 0, 2, 4, 6 u 8 semanas. Se midieron a la tasa de eclosión, b la tasa de emergencia y c la densidad de Wolbachia. Cada punto de datos representa una taza de 150 mosquitos (eclosión y emergencia) o un mosquito (densidad de Wolbachia); Se tomaron muestras de 24 a 40 mosquitos para cada grupo de densidad de Wolbachia. Los datos de la tasa de eclosión se analizaron mediante ANOVA (no significativo [ns]) y los datos se muestran como la media y el error estándar. Los datos de tasa de emergencia y densidad de Wolbachia se analizaron mediante un modelo lineal generalizado y los datos se muestran como medianas con rangos intercuartílicos

Encapsular los huevos para almacenarlos a 18 °C no mejora la aptitud de los huevos en comparación con 22 °C. Los huevos se empaquetaron en cápsulas solubles en agua con alimento para larvas o se dejaron en un sustrato de papel como control y se almacenaron a 18 °C o 22 °C (control) durante 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas. Se midieron a la tasa de eclosión b la tasa de emergencia yc las densidades de Wolbachia. Cada punto de datos representa una taza de 150 mosquitos (eclosión y emergencia) o un mosquito (densidad de Wolbachia); Se tomaron muestras de 24 a 40 mosquitos para cada grupo de densidad de Wolbachia. Los datos de la tasa de eclosión se analizaron mediante ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey (no significativo [ns], P < 0,01**) y los datos se muestran como la media y el error estándar. Las barras de importancia secundaria comparan la tasa de eclosión a lo largo del tiempo. Los datos de tasa de aparición y densidad de Wolbachia se analizaron mediante un modelo lineal generalizado y la prueba H de Kruskal-Wallis (P < 0,05*, P < 0,001***) y los datos se muestran como medianas con rangos intercuartílicos. Las barras de importancia secundaria de la tasa de aparición indican cambios a lo largo del tiempo. Las barras de significación secundaria de la densidad de Wolbachia comparan la semana 8 con el control de la semana 0 correspondiente

Impacto de las bajas temperaturas de almacenamiento de huevos en la viabilidad de los huevos y la densidad de adultos de Wolbachia. Los huevos infectados con WT, wMel y wAlbB sobre sustrato de papel se almacenaron a 26 °C, 12 °C y 4 °C durante 0, 8 o 48 h. a–c Se midieron la tasa de eclosión y la densidad de Wolbachia. Estos datos son representativos de dos réplicas experimentales combinadas. Cada punto de datos representa el promedio de tres tazas de 150 a 300 mosquitos (tasa de eclosión) o un mosquito (densidad de Wolbachia); Se tomaron muestras de 80 mosquitos para cada grupo de densidad de Wolbachia. Los datos de la tasa de eclosión se analizaron mediante ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey (no significativa [ns]) para comparar los cambios en la tasa de eclosión a lo largo del tiempo dentro de cada grupo. Los datos se muestran como media y desviación estándar. Los datos de densidad de Wolbachia se analizaron mediante la prueba H de Kruskal-Wallis y la prueba de rango con signo de Wilcoxon (P < 0,05*, P < 0,01**, P < 0,0001****) y los datos se muestran como mediana con rango intercuartílico

Impacto de las altas temperaturas de almacenamiento de huevos en la viabilidad de los huevos y la densidad de adultos de Wolbachia. Los huevos infectados de tipo salvaje (WT), wMel y wAlbB sobre sustrato de papel se almacenaron a 26 °C, 36 °C y 40 °C durante 0, 8 o 48 h. Se midieron la tasa de eclosión a–c y la densidad d–e de Wolbachia. Estos datos son representativos de dos réplicas experimentales combinadas. Cada punto de datos representa el promedio de tres tazas de 150 a 300 mosquitos (tasa de eclosión) o un mosquito (densidad de Wolbachia); Se tomaron muestras de 80 a 115 mosquitos para cada grupo de densidad de Wolbachia. Los datos de la tasa de eclosión se analizaron mediante ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey (no significativo [ns], P < 0,01**, P < 0,0001****) para comparar los cambios en la tasa de eclosión a lo largo del tiempo dentro de cada grupo. Los datos se muestran como media y desviación estándar. Los datos de densidad de Wolbachia se analizaron mediante la prueba H de Kruskal-Wallis y la prueba de rango con signo de Wilcoxon y los datos se muestran como mediana con rango intercuartílico

Para evaluar el efecto de encapsular los huevos en la aptitud del mosquito, almacenamos huevos infectados con WT, wMel y wAlbB dentro de cápsulas. Comparamos el efecto de la encapsulación, la infección por Wolbachia y el tiempo de almacenamiento de 8 semanas sobre la longevidad de los huevos en reposo, así como las tasas de emergencia de adultos resultantes y la densidad de Wolbachia. Al comparar cada línea de mosquitos nacida de huevos en sustrato de papel (control) con huevos encapsulados, la tasa de eclosión no se vio afectada de manera significativa, pero estuvo influenciada por el tiempo de almacenamiento, y la viabilidad de los huevos disminuyó con el tiempo para las tres líneas de mosquitos (ANOVA; tasa de eclosión: encapsulación). , F(1148) = 9,1727, P = 0,7791, tasa de eclosión: tiempo de almacenamiento, F(1148) = 31,9372, P < 0,0001****) (Fig. 1a). Un experimento repetido mostró una disminución pequeña pero significativa en la tasa de eclosión de huevos infectados con wMel y wAlbB cuando se encapsularon (Archivo adicional 1: Fig. S1a). De manera prometedora, las tasas de emergencia se mantuvieron altas, por encima de un promedio del 75 %, para todos los grupos hasta 8 semanas de almacenamiento y no se vieron afectadas negativamente por la encapsulación (GLM; P > 0,05 para todas las comparaciones) (Fig. 1b). Un experimento repetido mostró tendencias similares, aunque se observó una disminución significativa en la emergencia a las 8 semanas en el control WT y en los huevos infectados con wAlbB independientemente de la encapsulación (Archivo adicional 1: Fig. S1b). Al analizar la densidad de Wolbachia de los adultos emergidos, se encontró que, si bien la densidad cambió ligeramente con el tiempo (wAlbB generalmente aumentó y wMel disminuyó o se mantuvo constante) (GLM; densidad de Wolbachia: tiempo de almacenamiento, P = 0,0076**) la encapsulación no tuvo un impacto negativo en Wolbachia. densidad (GLM; densidad de Wolbachia: encapsulación, P = 0.159) (Fig. 1c). El experimento repetido también demostró esto (Archivo adicional 1: Fig. S1c). Juntos, estos experimentos indican que la encapsulación de huevos no exacerba el impacto negativo del tiempo de almacenamiento en la tasa de eclosión, ni tiene un impacto negativo en la aparición de adultos o la densidad de Wolbachia en mosquitos producidos a partir de huevos encapsulados almacenados hasta por 8 semanas.

A continuación, evaluamos el impacto de una temperatura de almacenamiento de 18 °C en la longevidad de los huevos encapsulados y la condición física de los adultos, según los resultados de Lau et al. [48] mostró que el almacenamiento de huevos infectados con Wolbachia a temperaturas más bajas puede prolongar la longevidad de los huevos. Este experimento se centró en wMel, ya que esta es la cepa de Wolbachia más utilizada en liberaciones de campo. Inicialmente, comparamos las tasas de eclosión de los huevos del control de sustrato de papel o las cápsulas almacenadas a cada temperatura. A 18 °C, la tasa de eclosión de huevos encapsulados fue significativamente menor que en los controles (comparación múltiple de Tukey; 18 °C, control: cápsula, Z = − 3,192 P = 0,0014**), mientras que a 22 °C, las tasas de eclosión de los huevos de control y encapsulados no fueron significativamente diferentes entre sí (comparación múltiple de Tukey; 22 °C, control: cápsula, Z = − 1.118, P = 0.2634) (Fig. 2a). Al considerar el efecto de la temperatura, las tasas de eclosión fueron ligeramente más altas cuando se almacenaron a 18 °C en comparación con los 22 °C tanto para los huevos de control como para los huevos encapsulados (comparación múltiple de Tukey; control, 18 °C: 22 °C, Z = 3,521 P = 0,0004***, cápsula, 18 °C: 22 °C, Z = 2,124, P = 0,0337*). Sin embargo, no se encontró que esto fuera una diferencia repetible (Archivo adicional 1: Fig. S2). Combinados, estos resultados respaldan que encapsular los huevos no tiene un impacto negativo en la viabilidad de los huevos en comparación con los controles y sugieren que la disminución de la temperatura de almacenamiento a 18 °C no afecta sustancialmente la viabilidad de los huevos.

Luego, las larvas se criaron hasta la edad adulta y se evaluó la emergencia y la densidad de Wolbachia. En particular, observamos una reducción en la emergencia después de 8 semanas de almacenamiento, que no se vio en la Fig. 1b, pero se observó en un experimento repetido (Archivo adicional 1: Fig. S1b), quizás debido a la variación del lote en la calidad del huevo y del alimento. . El análisis post hoc reveló que la reducción en la emergencia de adultos observada con el tiempo fue más significativa para los huevos de control almacenados a 22 °C, pero no estuvo influenciada por la encapsulación o la temperatura de almacenamiento (GLM; emergencia: encapsulación, P = 0,6574; emergencia: temperatura, P = 0.2738) (Fig. 2b). En general, la tasa de emergencia no se vio afectada por la encapsulación o el almacenamiento de huevos a 18 °C en comparación con 22 °C. La densidad de adultos de Wolbachia, aunque variable entre grupos, no mostró tendencias claras de cambio con el tiempo prolongado de almacenamiento de huevos (Fig. 2c). En particular, no se observó pérdida de Wolbachia en ningún grupo (una preocupación crítica para mantener la transmisión materna de Wolbachia en liberaciones de campo), y la encapsulación no fue una fuente de variación para la densidad de Wolbachia (prueba H de Kruskal-Wallis; densidad de Wolbachia: encapsulación , H = 1,164, P = 0,2806).

Los huevos de mosquito se transportan desde las instalaciones de producción hasta los sitios de liberación por vía aérea cuando los sitios locales de liberación no tienen la capacidad para la producción a gran escala. Cuando se transportan huevos, las temperaturas ambientales pueden alcanzar temperaturas máximas y mínimas extremas, lo que podría afectar la viabilidad de los huevos y la densidad de Wolbachia. Por lo tanto, comprender el rango de temperatura a través del cual los huevos permanecen viables y Wolbachia no se ve afectada negativamente es fundamental para garantizar un control de alta calidad. Para probar esto, almacenamos huevos en sustrato de papel a temperaturas que oscilan entre 4 y 40 °C y eclosionamos después de 8 o 48 h de almacenamiento para evaluar la viabilidad de los huevos. Las bajas temperaturas (4 °C y 12 °C) no afectaron negativamente la viabilidad del huevo de WT (comparación múltiple de Tukey, 0 h: 48 h; 12 °C, Z = − 2.051, P = 0.1002; 4 °C, Z = − 1,638, P = 0,2295), infectados con wMel (comparación múltiple de Tukey, 0 h: 48 h; 12 °C, Z = − 0,443, P = 0,8976; 4 °C, Z = 0,071, P = 0,9973) o infectados con wAlbB huevos (comparación múltiple de Tukey, 0 h: 48 h; 12 °C, Z = − 0,299, P = 0,9519; 4 °C, Z = − 1,5 P = 0,2909) (Fig. 3a). Luego, las larvas se criaron a 26 °C y se tomaron muestras de adultos para medir la densidad de Wolbachia. La densidad de wMel se vio afectada negativamente por las bajas temperaturas (prueba H de Kruskal-Wallis; densidad de wMel Wolbachia: temperatura de almacenamiento, H = 17,614, P = 0,0002*** mientras que wAlbB no se vio afectada negativamente, sino que mostró un ligero aumento en la densidad (prueba de Kruskal-Wallis). -Prueba H de Wallis; densidad de wAlbB Wolbachia: temperatura de almacenamiento, H = 7,7577, P = 0,0208*) (Fig. 3d-e). Hubo dos casos (de 160 muestras) de pérdida de wMel cuando los huevos se almacenaron a 4 °C (Fig. 3d).

Luego, almacenamos huevos a altas temperaturas de 36 °C y 40 °C. La viabilidad de los huevos infectados con WT y wMel se mantuvo cuando los huevos se expusieron a 36 °C, mientras que la viabilidad de los huevos infectados con wAlbB disminuyó ligeramente. Las tres líneas tuvieron una viabilidad significativamente menor cuando se almacenaron a 40 °C durante 48 h (comparación por pares de Tukey, 40 °C, 0 h: 48 h; WT, Z = − 7,36, P < 0,0001****; wMel, Z = − 9.894, P < 0.0001****;wAlbB, Z = − 3.876, P = 0.0003***) (Fig. 4a–c). Sin embargo, la viabilidad de los huevos infectados con wAlbB fue inconsistente en los experimentos repetidos. Ambas réplicas experimentales indicaron una disminución significativa en la viabilidad almacenada a 36 °C después de 48 h, mientras que en una repetición experimental, 40 °C no tuvo un impacto significativo en la viabilidad del huevo. Se observó poco o ningún impacto en la densidad de Wolbachia en adultos que emergieron de huevos almacenados a 36 °C (prueba de rango con signo de Wilcoxon, densidad de Wolbachia a 36 °C, 8 h: 48 h; wMel, Z = − 3,0538, P = 0,0023* *;wAlbB, Z = − 1.4402, P = 0.1498) (Fig. 4d). Sin embargo, la densidad disminuyó significativamente cuando los huevos se almacenaron a 40 °C durante 48 h, donde se observó una pérdida casi completa de Wolbachia en la mayoría de los adultos infectados con wMel y wAlbB (prueba de rango con signo de Wilcoxon, densidad de Wolbachia a 40 °C, 8 h: 48 h; wMel, Z = − 8,2106, P < 0,0001****; wAlbB, Z = − 8,2106, P < 0,0001****) (Fig. 4e). Estos datos demuestran que si los huevos se exponen a temperaturas de 40 °C o más durante 48 h, deben desecharse, ya que la viabilidad disminuirá significativamente y es poco probable que los adultos que emergen estén infectados con Wolbachia.

Hasta la fecha, Wolbachia se ha establecido con éxito en Ae. aegypti en ciudades de todo el mundo para proteger a 10 millones de personas de enfermedades transmitidas por mosquitos [50]. Esta sigue siendo una pequeña proporción de la población mundial en riesgo de contraer dengue, estimada entre 2920 y 3970 millones de personas [1]. A medida que programas como los que implementan la introgresión de Wolbachia, la conducción genética o la modificación genética, se amplían y funcionan en nuevas regiones, requieren un método económico y eficiente en recursos para la liberación masiva de mosquitos. La liberación de mosquitos en la etapa de huevo es atractiva, ya que pueden producirse fuera del sitio y luego enviarse a las áreas de liberación, lo que elimina la necesidad de instalaciones locales para la cría de mosquitos. Además, se pueden utilizar para fomentar la participación de la comunidad al involucrar a los residentes en el proceso de retaguardia y liberación [36]. Este método supera los obstáculos financieros y regulatorios asociados con el establecimiento de instalaciones en el sitio; sin embargo, mantener la calidad del huevo y la infección por Wolbachia es esencial para un despliegue exitoso [62]. Por lo tanto, las cápsulas de huevos y alimentos ofrecen la oportunidad de mejorar la escalabilidad de las liberaciones de huevos. Nuestro estudio probó el almacenamiento a largo plazo de huevos dentro de cápsulas como un método que podría ayudar a la distribución masiva de huevos.

De manera prometedora, descubrimos que encapsular los huevos no tiene un impacto negativo en la viabilidad de los huevos infectados con WT, wMel o wAlbB. Con el tiempo, la viabilidad de los huevos disminuyó en líneas infectadas y no infectadas con Wolbachia; sin embargo, la encapsulación no exacerbó esta pérdida. Existe una extensa literatura que evidencia que los huevos infectados con Wolbachia pierden viabilidad más rápido que los WT [40,41,42,43,44,45,46,47,48]. Si bien aún no está claro por qué ocurre esto, es importante saber que la encapsulación no afecta más la viabilidad del huevo con el tiempo. La tasa de emergencia y la densidad de Wolbachia adulta tampoco se vieron afectadas por la encapsulación o el tiempo de almacenamiento. En general, independientemente del estado de infección por Wolbachia, los huevos encapsulados no fueron más susceptibles a una aptitud física reducida.

A continuación, probamos si reducir la temperatura de almacenamiento a 18 °C podría mejorar la viabilidad de los huevos encapsulados y el estado físico de los adultos en comparación con 22 °C. Si bien esto es más bajo que el rango ideal definido para el almacenamiento de huevos de Aedes WT de entre 20 y 26 °C y 70 y 85 % de HR de un estudio [63], otros han demostrado que las temperaturas de almacenamiento de huevos más bajas pueden prolongar la longevidad del huevo en comparación con temperaturas más altas. temperaturas [48, 64]. Descubrimos que la viabilidad de los huevos infectados con wMel no se vio afectada al reducir la temperatura de almacenamiento a 18 °C. El impacto negativo del almacenamiento de huevos aumentó con el tiempo, particularmente en los huevos almacenados a 22 °C, pero esto fue independiente de la encapsulación. En consecuencia, las tasas de emergencia también se redujeron con el tiempo, posiblemente debido a una sobreabundancia de alimentos que puede conducir a malas condiciones del agua que no son adecuadas para la salud de los mosquitos acuáticos [65]. La densidad de Wolbachia no se vio afectada por la encapsulación y el tiempo. Si bien los impactos del almacenamiento a 18 °C en la viabilidad de los huevos fueron algo inconsistentes aquí, se podría realizar un trabajo futuro para determinar si se puede establecer una temperatura ideal para Ae infectado con Wolbachia. longevidad del huevo de aegypti. En general, encapsular los huevos y almacenarlos a 18–22 °C no tuvo un impacto negativo en las medidas de aptitud de los mosquitos.

En la aplicación de campo de la liberación de huevos, el Programa Mundial de Mosquitos utiliza transporte aéreo para entregar huevos en sitios de liberación que no pueden soportar la producción en masa en el sitio, lo que deja a los huevos vulnerables a la exposición a temperaturas extremas. Actualmente, los envíos tienen como objetivo mantener temperaturas entre 15 y 25 °C. Sin embargo, los registradores de datos transportados con los huevos indican que las temperaturas pueden salir de este rango, especialmente cuando se envían a lugares remotos con tiempos de envío de hasta 5 días [62]. Obtener una comprensión detallada de las condiciones a las que son vulnerables la viabilidad de los huevos y la densidad de Wolbachia informará a los sitios del proyecto sobre el impacto potencial en la calidad del huevo si las reservas de huevos están expuestas a temperaturas extremas. Medimos el impacto de la exposición a corto plazo (48 h) de los huevos a 4–40 °C sobre la viabilidad de los huevos y la densidad de Wolbachia adulta resultante. A 4 °C y 8 °C, la viabilidad de los huevos y la densidad de wAlbB no se vieron afectadas. La densidad de wMel disminuyó a 4 °C, pero solo hubo dos casos de pérdida de Wolbachia de las 160 muestras analizadas. Estudios previos también han demostrado que Ae. Los huevos de aegypti son tolerantes a las bajas temperaturas y mantienen una alta viabilidad cuando se depositan y almacenan a 16 °C [49, 67]. A altas temperaturas, la viabilidad de los huevos y la densidad de Wolbachia no se vieron afectados por la exposición a 36 °C, pero se vieron significativamente afectados negativamente cuando se almacenaron a 40 °C durante 48 h. La pérdida de Wolbachia de las existencias de huevos es perjudicial porque estos huevos ya no se pueden utilizar para liberaciones de introgresión de Wolbachia. De hecho, liberar hembras libres de Wolbachia aumentaría los vectores virales potenciales dentro de una población. Las tres líneas se comportaron de manera similar, con la excepción de wAlbB en una repetición experimental, que mantuvo la viabilidad a 40 °C a pesar de la viabilidad reducida a 36 °C. Dada la inconsistencia de estos resultados, no está claro si los huevos wAlbB funcionan mejor a esta temperatura más alta. Se ha descubierto que wAlbB es relativamente estable a altas temperaturas (26–37 °C) en comparación con wMel [47, 68,69,70]. Ross et al. [69] descubrió que, si bien wAlbB era más tolerante a la temperatura, la viabilidad de los huevos disminuía a un ritmo similar al de los huevos infectados con wMel cuando se exponían a temperaturas cíclicas durante 1 semana que alcanzaban un máximo de 38 °C o más. La densidad de wMel adulta disminuyó después de temperaturas máximas de almacenamiento de huevos de 36 °C, mientras que wAlbB se mantuvo bajo todas las temperaturas (la viabilidad de los huevos se perdió antes de que se observara una disminución en wAlbB) [69]. Nuestros datos sugieren que wAlbB es susceptible de abandonarse a altas temperaturas agudas. Aunque wAlbB es más tolerante a la temperatura, Lau et al. [48], mostró que si los huevos se almacenan a altas temperaturas (22–30 °C) durante más de 6 semanas, la fertilidad de las hembras infectadas con wAlbB derivadas de los huevos disminuye significativamente, mientras que la fertilidad de wMel y WT permanece estable. En este estudio no observamos un efecto de fitness negativo significativo de wAlbB. Sin embargo, como nuestros métodos no evaluaron la fertilidad, nuestros resultados pueden subestimar los impactos de wAlbB en Ae. aegypti. Ante esto, se debe tener cuidado de no exponer los huevos a altas temperaturas cuando se almacenan por largos períodos de tiempo. Si bien los huevos no se encapsularon en estos experimentos, es probable que se apliquen límites de temperatura similares, pero se requieren más pruebas en caso de que las temperaturas dentro de las cápsulas difieran de la temperatura ambiente. Estos resultados brindan información sobre el impacto de la exposición a temperaturas extremas en Ae. aegypti para garantizar que los recursos no se desperdicien en reservas de huevos no viables.

En resumen, nuestro trabajo ha demostrado que encapsular huevos con alimento para larvas y almacenarlos durante un período de 8 semanas no afecta negativamente la viabilidad de los huevos ni la aparición de adultos resultante ni la densidad de Wolbachia en comparación con el método de almacenamiento de huevos de control. Además, establecimos que la viabilidad de los huevos y la densidad de Wolbachia adulta se mantienen bien cuando se exponen a 4–36 °C durante 48 h, pero ambas se reducen significativamente cuando los huevos se almacenan a 40 °C durante > 8 h. Los métodos de biocontrol de liberación masiva de insectos se basan en el mantenimiento de la aptitud de los insectos con métodos de introgresión de Wolbachia que además requieren una alta prevalencia de infección por Wolbachia. Las liberaciones de huevos basadas en cápsulas mejoran la facilidad y la escala a la que los huevos y el alimento para larvas pueden dividirse en alícuotas y transportarse de manera uniforme al campo. En comparación con las liberaciones de pupas o adultos, las cápsulas también brindan un beneficio logístico sustancial para las liberaciones masivas de insectos debido a la reducción de los requisitos de recursos en el sitio. En general, este trabajo mejora nuestra comprensión de los factores que influyen en Ae. aegypti fitness y proporciona evidencia de un método mejorado de liberación de huevos que podría ayudar a la aplicación a gran escala de la introgresión de Wolbachia.

Todos los datos se proporcionan dentro del texto y archivos adicionales.

Aedes

Tipo salvaje

virus del dengue

virus zika

virus chikungunya

Humedad relativa

Osmosis inversa

Proteína de superficie de Wolbachia

Proteína de superficie ribosomal S17

Expresión normalizada

Modelo lineal generalizado

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Agradecemos a Peter Kyrylos del World Mosquito Program por desarrollar y proporcionar el ensayo wAlbB141 qPCR y proporcionar las secuencias de los cebadores.

Esta investigación fue apoyada por fondos de la Beca del Programa de Capacitación en Investigación (RTP) del Gobierno de Australia.

Instituto de Enfermedades Transmitidas por Vectores, Universidad de Monash, Melbourne, VIC, 3800, Australia

Megan J. Allman, Cameron P. Simmons, Heather A. Flores y Johanna E. Fraser

Departamento de Microbiología, Universidad de Monash, Melbourne, VIC, 3800, Australia

Megan J. Allman y Johanna E. Fraser

Programa Mundial de Mosquitos, Universidad de Monash, Melbourne, VIC, 3800, Australia

Ya-Hsun Lin, D. Albert Joubert, Jessica Addley-Cook, Maria Camila Mejía-Torres & Cameron P. Simmons

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Monash, Melbourne, VIC, 3800, Australia

brezo a. flores

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Conceptualización, análisis formal, investigación, metodología, administración de proyectos, validación, visualización y redacción-borrador original, revisión y edición, MJA; conceptualización, investigación, metodología, supervisión y redacción-revisión y edición, YHL y DAJ; investigación y edición, JAC y MCMT; metodología, supervisión, validación y redacción-revisión y edición, CPS, HAF y JEF. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Heather A. Flores o Johanna E. Fraser.

Para producir los huevos utilizados en estos experimentos, las colonias de mosquitos se alimentaron con sangre de voluntarios humanos adultos de acuerdo con el permiso de ética de investigación humana de la Universidad de Monash número 27690, o se les suministró sangre humana obtenida de la Cruz Roja Australiana, según el Acuerdo de Suministro 22-05VI-04 con la Programa Mundial de Mosquitos Ltd.

Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Secuencias de cebador y sonda de qPCR. Figura S1. Repita el experimento de datos en la Fig. 1: encapsular los huevos para almacenarlos a 22 °C no exacerba los impactos en la viabilidad de los huevos, la aparición de adultos o la densidad de Wolbachia en comparación con los controles. Figura S2. Repita el experimento de datos en la Fig. 2. Encapsular huevos para almacenarlos a 18 °C no mejora la aptitud de los huevos en comparación con 22 °C.

Conjunto de datos S1: Salidas estadísticas.

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Reimpresiones y permisos

Allman, MJ, Lin, YH., Joubert, DA et al. Mejora de la escalabilidad de la gestión de enfermedades transmitidas por vectores basada en Wolbachia: límites de tiempo y temperatura para el almacenamiento y transporte de huevos de Aedes aegypti infectados con Wolbachia para su liberación en el campo. Vectores de parásitos 16, 108 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05724-1

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Recibido: 05 enero 2023

Aceptado: 02 de marzo de 2023

Publicado: 18 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05724-1

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